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簡要描述:GV3101 (pJIC SA_Rep)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞GV3101(pJIC SA_Rep)菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,pJIC SA_Rep即為GV3101(pJIC SA_Rep)菌株,可幫助pgR106,pgR107,pGreen,pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制,同時賦予該菌株四環(huán)素(tet)抗性,適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。
更新時間:2022-01-21
廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
瀏覽次數(shù):1200
品牌 | 其他品牌 | 貨號 | BFNC86107 |
---|---|---|---|
規(guī)格 | 10x100ul/50x100ul | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 僅用于科研 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
GV3101 (pJIC SA_Rep)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86107-01(10×100ul)/BFNC86107-02(50×100ul)
GV3101 (pJIC SA_Rep) Elec: 50μl/支
pGs2(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期): -80℃(12個月)
基因型
C58 (rifR) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR) Nopaline(pJIC SA_Rep -tetR)
產(chǎn)品說明
GV3101(pJIC SA_Rep)菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pMP90 (pTiC58DT-DNA),此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pMP90 (pTiC58DT-DNA)型Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽:gent,賦予GV3101菌株慶大霉素抗性;在GV3101菌株中轉(zhuǎn)入help質(zhì)粒:pJIC SA_Rep即為GV3101(pJIC SA_Rep)菌株,可幫助pgR106,pgR107,pGreen,pGs2系列質(zhì)粒在農(nóng)桿菌中復(fù)制,同時賦予該菌株四環(huán)素(tet)抗性,適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作。
青旗生物生產(chǎn)的GV3101(pJIC SA_Rep)電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:經(jīng)pGs2(卡那霉素抗性)質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>106 cfu/μg。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高,*使用前盡量做預(yù)實驗確定所加質(zhì)粒的量),用手bo打管底混勻,立即插入冰中,用200 μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?;旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上杯蓋,空管保留待用。
3. 啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
(當(dāng)平板只含有50 μg/ml kan 時,28℃培養(yǎng)48 h即可;平板中同時加入50 μg/ml kan,20 μg/ml rif 時,需28℃培 養(yǎng)60 h;如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90 h)。
GV3101 (pJIC SA_Rep)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
備注
1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧芐青霉素(carb) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素(kan) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
鏈霉素(strep) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平(rif) | DMSO溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
慶大霉素(gent) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
2、常用農(nóng)桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)
農(nóng)桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
AGL-1 | R | S | R | S | S |
EHA101 | S | S | R | S | R |
EHA105 | S | S | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | S | R | R | S |
3、LB及YEB配方:
component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
Agar | - | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 | |||
Agar | - | 15 g |
注意事項
1. 加入質(zhì)粒時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)??上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量,本公司生產(chǎn)的GV3101(pJIC SA_Rep)感受態(tài)細(xì)胞具有四環(huán)素抗性,但在轉(zhuǎn)入目標(biāo)質(zhì)粒涂板篩選陽性克隆時,只需加入目標(biāo)質(zhì)??剐缘目股?,不加四環(huán)素。
3. 平板上陽性克隆密度過大時,由于營養(yǎng)不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應(yīng)減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,會降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,培養(yǎng)農(nóng)桿菌時不考慮鏈霉素或慶大霉素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低 (可以忽略)。