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簡要描述:EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞EHA101菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA),適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。
更新時(shí)間:2022-01-21
廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
瀏覽次數(shù):1094
品牌 | 其他品牌 | 貨號 | BFNC86111 |
---|---|---|---|
規(guī)格 | 10x100ul/50x100ul | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 僅用于科研 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86111-01(10×100ul)/BFNC86111-02(50×100ul)
EHA101 Elec: 50μl/支
pK7WGF2(control vector,10ng/μl ) 10μl
保存條件(保質(zhì)期): -80℃(12個(gè)月)
基因型
C58 (rifR) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR) Nopaline
產(chǎn)品說明
EHA101菌株為C58型背景,核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因rif,為了便于轉(zhuǎn)化操作,此菌株攜帶一無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型Ti質(zhì)粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA),此質(zhì)粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因組必需的元件,pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)質(zhì)粒自身的T-DNA轉(zhuǎn)移功能被破壞,但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體T-DNA順利轉(zhuǎn)移)。pEHA101 (pTiBo542DT-DNA) 型Ti質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽:kan,賦予EHA101菌株卡那霉素抗性,適用于玉米、水稻、煙草等植物的轉(zhuǎn)基因操作。
青旗生物生產(chǎn)的EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)特別適用于大質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:經(jīng)pK7WGF2質(zhì)粒 (壯觀霉素抗性,size:11876 bp)檢測轉(zhuǎn)化效率>105 cfu/μg DNA;經(jīng)pK7WGF2-ZH質(zhì)粒(size:40 kb)檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×103 cfu/μg DNA。。
操作方法
1. 0.1 cm電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,使乙醇充分揮發(fā),待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)插入冰中5分鐘,待其融化,加入0.01-1 μg質(zhì)粒DNA(體積不大于6ul,感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率較高,*使用前盡量做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定所加質(zhì)粒的量),用手bo打管底混勻,立即插入冰中,用200μl槍頭將感受態(tài)-質(zhì)?;旌衔锟焖僖频诫姄舯校w上杯蓋,空管保留待用。
3. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 ohm,V=2400 V(此參數(shù)為Biorad 推薦,使用者也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的protocol操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中,加入700 μl無抗生素的LB并轉(zhuǎn)移到感受態(tài)空管中,28℃振蕩培養(yǎng)2~3小時(shí)。
4. 6000 rpm離心一分鐘收菌,留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-3天
(當(dāng)平板只含有轉(zhuǎn)化所用雙元載體抗生素時(shí),28℃培養(yǎng)48小時(shí)即可;平板中同時(shí)加入雙元載體抗生素,20 μg/ml rif 時(shí),需28℃培養(yǎng)60小時(shí);如果使用的平板含有50 μg/ml rif 則需要28℃培養(yǎng)72-90小時(shí))。
EHA101電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
備注
1、農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方:
抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
羧芐青霉素(carb) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
硫酸卡那霉素(kan) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 50 mg/ml | 50 μg/ml |
鏈霉素(strep) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 50 μg/ml |
利福平(rif) | DMSO溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 10 mg/ml | 20 μg/ml |
慶大霉素(gent) | 雙蒸水溶解,0.22 μm濾膜過濾除菌 | 20 mg/ml | 40 μg/ml |
2、常用農(nóng)桿菌抗性:(R:抗;S:敏感。)
農(nóng)桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
AGL-1 | R | S | R | S | S |
EHA101 | S | S | R | S | R |
EHA105 | S | S | R | S | S |
LBA4404 | S | R | R | S | S |
GV3101 | S | S | R | R | S |
3、LB及YEB配方:
component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
Tryptone | 10 g | 10 g | Tryptone | 5 g | 5 g |
Yeast extract | 5 g | 5 g | Yeast extract | 1 g | 1 g |
NaCl | 10 g | 10 g | 牛肉浸膏 | 5 g | 5 g |
NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 | 蔗糖 | 5 g | 5 g |
Agar | - | 15 g | MgSO4*7H2O | 0.49 g | 0.49 g |
NaOH | 調(diào)PH到7.0 | 調(diào)PH到7.0 | |||
Agar | - | 15 g |
注意事項(xiàng)
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10;質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染,轉(zhuǎn)化效率急劇下降;質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)??上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。
3. 平板上陽性克隆密度過大時(shí),由于營養(yǎng)不足,陽性克隆生長變慢,菌落變小,為了獲得大的菌落,應(yīng)減少質(zhì)粒用量。
4. 利福平濃度不應(yīng)高于25 μg/ml,過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長,會(huì)降低其生長速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有50 μg/ml kan,若所用平板含有20 μg/ml rif則轉(zhuǎn)化效率降低到1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長、篩選農(nóng)桿菌;根據(jù)所用菌株抗性加入Ti質(zhì)粒篩選抗生素可防止Ti質(zhì)粒丟失,但Ti質(zhì)粒篩選抗生素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作,所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮這些抗生素,Ti質(zhì)粒丟失的概率極低(可以忽略)。