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簡要描述:GT115菌株,是專門用來克隆含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)或重復(fù)序列等DNA二級結(jié)構(gòu)的基因序列的大腸桿菌菌株。青旗生物生產(chǎn)的GT115電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達1×1010 cfu/μg DNA。
更新時間:2022-01-20
廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
瀏覽次數(shù):1336
品牌 | 其他品牌 | 貨號 | BFNC86052 |
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規(guī)格 | 5x50ul/20x50ul | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 僅用于科研 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
GT115電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞
產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86052-01(5×50ul)/BFNC86052-02(20×50ul)
GT115 Electroporation-Competent Cell 50μl/支
pUC19 (control vector,10pg/μl): 10μl
保存條件(保質(zhì)期): -80℃(6個月)
基因型
F- mcrA?(mrr-hsdRMS-mcrBC) f80lacZDM15?lacX74 recA1 rpsL (StrR) endA1 ?dcm uidA(DMluI)::pir-116?sbcC-sbcD
產(chǎn)品說明
GT115菌株,是專門用來克隆含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)或重復(fù)序列等DNA二級結(jié)構(gòu)的基因序列的大腸桿菌菌株。大腸桿菌中存在一種SbcCD蛋白復(fù)合體,可以識別DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu),并將其切除;將sbcC和sbcD兩個基因突變,增強了發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA的穩(wěn)定性。同時在大腸桿菌基因組中引入uidA(DMluI)::pir-116,使GT115可以表達 兀 蛋白,含有R6Kg ori復(fù)制子的質(zhì)粒( pCpG-mcs、pCpG-LacZ、pCpG-siRNA …)可以正常復(fù)制。rpsL賦予GT115鏈霉素抗性,同時該菌株還含有核酸酶 (endA)突變、重組酶 (recA)突變,增強了外源DNA的穩(wěn)定性。
青旗生物生產(chǎn)的GT115電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達1×1010 cfu/μg DNA。
操作方法
1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的GT115電擊感受態(tài)細胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA (質(zhì)粒或連接產(chǎn)物)并用手bo打EP管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。
A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒 pUC19;
B. 對于連接產(chǎn)物,大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與GT115電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化,無需進行DNA純化,但DNA濃度不能過高,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。
C. 對鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸,然后與GT115電擊感受態(tài)混合進行電擊轉(zhuǎn)化。
3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。
4. 啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。
5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無菌S.O.C. 培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘。
6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)13-17小時。
GT115電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞
S.O.C 培養(yǎng)基配方
2% Tryptone
0.5% Yeast Extract
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM glucose
PH-7.0
S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).
注意事項
1. 加入DNA時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。
2. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。
3. 當(dāng)DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo),增大在含有細胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。
5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?;蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率,推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。
6. 對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,部分公司的連接體系或重組體系(例如:Thermo,NEB公司的T4 連接酶系統(tǒng),NEB,天根的50度反應(yīng)重組系統(tǒng))可以直接與GT115電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化,無需純化,但DNA濃度不能過高,盡量不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率,增加弧光放電的風(fēng)險。
7. 混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作,吸取感受態(tài)細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。
8. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞盡量保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。