歡迎您,來到青旗(上海)生物技術(shù)發(fā)展有限公司!
Product category
Related articles
簡要描述:ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化,不能用于熱激轉(zhuǎn)化。ClearColi K12菌株來源于K12 endA- recA-菌株。ClearColi K12同時缺失核酸內(nèi)切酶 (endA)和重組酶 (recA),提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。
更新時間:2022-01-20
廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
瀏覽次數(shù):1328
品牌 | 其他品牌 | 貨號 | BFNC86053 |
---|---|---|---|
規(guī)格 | 5x50ul/20x50ul | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 僅用于科研 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86053-01(5×50ul)/BFNC86053-02(20×50ul)
ClearColi K12 Electro Cell 50μl/支
pUC19 (control vector,10pg/μl): 10μl
恢復(fù)培養(yǎng)基 50ml/瓶
保存條件(保質(zhì)期): -80℃(6個月)
基因型
F–λ–?endA–?recA–frr181 msbA52 ?gutQ ?kdsD ?lpxL ?lpxM ?pagP ?lpxP ?eptA
產(chǎn)品說明
ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化,不能用于熱激轉(zhuǎn)化。ClearColi K12菌株來源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突變,導(dǎo)致ClearColi K12細(xì)胞壁外層的脂多糖(LPS)被修飾:LPS的低聚糖鏈被刪除,同時LPS的兩個酰基鏈也被刪除,進(jìn)而破壞了ClearColi K12大腸桿菌的內(nèi)毒素信號通路,使得從該細(xì)胞中提取的蛋白或質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素含量極低,提取的無內(nèi)毒素質(zhì)粒廣泛應(yīng)用于后續(xù)的哺乳動物細(xì)胞轉(zhuǎn)化。ClearColi K12同時缺失核酸內(nèi)切酶 (endA)和重組酶 (recA),提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。
青旗生物開發(fā)的ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×107 cfu/μg DNA。
ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
操作方法
1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。
2. 取-80℃保存的ClearColi K12電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘,待其融化,加入目的DNA ,并用手bo打EP管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。
A. 測定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對照質(zhì)粒 pUC19;
B. 對于未知來源或組分不明的質(zhì)粒DNA,請用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸,DNA濃度不超過100 ng/μl,體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。
3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。
4. 啟動電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。
5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入1ml不含抗生素的無菌恢復(fù)培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加恢復(fù)培養(yǎng)基(室溫)至10 ml。37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘。
6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的LB(務(wù)必使用高鹽培養(yǎng)基平板,不可用2YT,SOB,SOC等低鹽培養(yǎng)基)平板上(因菌量較大,若全部涂板請選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個)。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時(培養(yǎng)24小時后可看到很小的克隆)。
LB培養(yǎng)基1L(PH:7.0):
Yeast Extract 5g
NaCl 10g
Tryptone 10g
注意事項(xiàng)
1. 因ClearColi K12細(xì)胞壁外層的脂多糖(LPS)被修飾,細(xì)胞易死亡,不易保存,平板菌在4度存放時間應(yīng)不超過1周。且適合在高鹽培養(yǎng)基中生長。
2. ClearColi K12電擊感受態(tài)效率很低,不適用于構(gòu)建質(zhì)粒使用,一般用來擴(kuò)繁質(zhì)粒,提取高質(zhì)量的無內(nèi)毒素的質(zhì)粒;若構(gòu)建質(zhì)粒,請選用DH5a、*0等轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細(xì)胞。
3. ClearColi K12菌株生長緩慢,平板在37度培養(yǎng)時間在36-48小時之間。
4. 加入DNA時體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。
5. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會增加弧光放電風(fēng)險。
6. 當(dāng)DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
7. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo),增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險。
8. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?;蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率,推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個數(shù)量級。
9. 對于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,盡量轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產(chǎn)物,保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會降低轉(zhuǎn)化效率,增加弧光放電的風(fēng)險。
10. ClearColi K12菌株的細(xì)胞壁被修飾過,細(xì)胞比較脆弱,混入質(zhì)粒時應(yīng)輕柔操作,吸取感受態(tài)細(xì)胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜,降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒或連接產(chǎn)物可相應(yīng)減少用于涂板的菌量。
11. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞盡量保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會下降。