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簡要描述:Y190感受態(tài)細胞Y190菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株,MATa型,可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)?;蚺cMATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。
更新時間:2022-01-20
廠商性質(zhì):生產(chǎn)廠家
瀏覽次數(shù):1076
品牌 | 其他品牌 | 貨號 | BFNC86063 |
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規(guī)格 | 10x100ul/50x100ul | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
主要用途 | 僅用于科研 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
Y190感受態(tài)細胞
產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86063-01(10×100ul)/BFNC86063-02(50×100ul)
Y190 Competent Cell: 100μl/支 保存: -80℃(3個月)
pGADT7 (control vector, 10 ng/μl) 10μl 保存:-80℃(12個月)
Carrier DNA (10 μg/μl) 100μl 保存:-20℃(12個月)
PEG/LiAC: 5ml 保存: 4℃(12個月)
基因型
MATa, ura3-52, his3-200, ade2-101, lys2-801, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, cyhr2, LYS2 : : GAL1
UAS-HIS3TATA-HIS3, MEL1 URA3 : : GAL1UAS-GAL1TATA-lacZ
產(chǎn)品說明
Y190菌株是Clontech公司開發(fā)的GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株,MATa型,可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進行蛋白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker為: trp1,leu2,cyh2;報告基因為: lacZ,HIS3,MEL1。Y190-GAL4酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質(zhì)粒配套使用:(pGB和pACT2)或(pGBKT7和pGADT7)。質(zhì)粒pGB由pGBKT7改造而來,篩選標志為TRP1,用于表達DNA-BD(來自酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4N端1~ 174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白;質(zhì)粒pACT2與pGADT7的結(jié)構(gòu)和功能類似,篩選標志為LEU,用于表達AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。GAL4系統(tǒng)原理:一個完整的酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4可分為功能上相互獨立的兩個結(jié)構(gòu)域:位于N端1~174位氨基酸區(qū)段的DNA結(jié)合域 (DNA-BD)和位于C端768~881位氨基酸區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。DNA-BD能夠識別GAL4-responsive gene的上游激活序列UAS,并與之結(jié)合。而AD可以啟動UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。BD和AD單獨存在不能激活轉(zhuǎn)錄,但當二者接近時,則呈現(xiàn)完整的GAL4活性,使含有UAS的啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄表達。正常條件下,BD不與AD結(jié)合,將要檢測的蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合,形成 bait融合蛋白(bait –BD)和 prey融合蛋白 (prey-AD),如果 bait和 prey發(fā)生相互作用,就會促使 BD和 AD的相互接近,形成完整的GAL4,從而激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。
青旗生物的Y190感受態(tài)細胞經(jīng)特殊工藝制作,-80℃可保存三個月,pGADT7質(zhì)粒檢測轉(zhuǎn)化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法
1. Carrier DNA 在每次使用前要通過加熱處理使其變性為單鏈狀態(tài),步驟如下:Carrier DNA 放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min,再次放95℃水浴或金屬浴3 min,快速插入冰中,靜置3 min以上。
2. 取100 µl冰上融化的Y190感受態(tài)細胞,依次加入預(yù)冷的目的質(zhì)粒0.5-3 µg,Carrier DNA10 µl,PEG/LiAc 500 µl并吸打幾次混勻,30℃水浴30 min (15 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
3. 將管放42℃水浴15 min (7.5 min時翻轉(zhuǎn)6-8次混勻)。
4. 5000 rpm離心 40 s棄上清,ddH2O 400 µl 重懸,離心 30s棄上清。
5. ddH2O 50 µl重懸,涂板,29℃培養(yǎng)48-96 h。
Y190感受態(tài)細胞
注意事項
1. 感受態(tài)細胞盡量在冰上融化。
2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。
3. 同時轉(zhuǎn)化2-3種質(zhì)粒時應(yīng)增加質(zhì)粒的用量。
4. Y190酵母菌株對高溫敏感,適生長溫度為27-30℃;高于31℃,生長速度和轉(zhuǎn)化效率呈指數(shù)下降。
5. 菌落變粉不是污染,是酵母細胞生長中一個常見現(xiàn)象。當細胞在平板培養(yǎng)幾天后,平板上的Adenine被酵母消耗完畢,酵母試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用,然而,有些菌株的ADE2基因被破壞,Adenine合成途徑受阻;又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常,所以造成中間產(chǎn)物P-ribosylamino imidazole (AIR) 在細胞中積累而使菌落變?yōu)榉奂t色。
6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比YPDA培養(yǎng)基慢,培養(yǎng)基中缺陷成分越多,生長越慢,以轉(zhuǎn)化涂板為例:涂YPDA平板29℃,48 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆;涂SD單缺平板29℃,48-60 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆,涂SD雙缺平板29℃,60-80 h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆,涂SD三缺或四缺平板平板29℃,80-90h培養(yǎng)可見直徑1 mm克隆。