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BL21(DE3)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

BL21(DE3)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

簡(jiǎn)要描述:BL21(DE3)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞
BL21(DE3)為L(zhǎng)on蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷菌株。λ噬菌體DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶,該區(qū)整合于BL21的染色體上,所以稱(chēng)為BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶,用于pET系列,pGEX,pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。

更新時(shí)間:2022-01-20

廠(chǎng)商性質(zhì):生產(chǎn)廠(chǎng)家

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詳情介紹
品牌其他品牌貨號(hào)BFNC86092
規(guī)格5x50ul/20x50ul供貨周期現(xiàn)貨
主要用途僅用于科研應(yīng)用領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè)

BL21(DE3)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞



產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86092-01(5×50ul)/BFNC86092-02(20×50ul)

BL21(DE3) Electroporation-Competent Cell                  50μl/支

pUC19 (control vector,10pg/μl):                                        10μl

保存條件(保質(zhì)期):                                                 -80℃(6個(gè)月)


基因型

F- ompT hsdSB(rB- mB- ) gal dcm(DE3)


產(chǎn)品說(shuō)明

BL21(DE3)為L(zhǎng)on蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷菌株。λ噬菌體DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶,該區(qū)整合于BL21的染色體上,所以稱(chēng)為BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶,用于pET系列,pGEX,pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。

青旗生物生產(chǎn)的BL21(DE3)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作,pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)1×1010 cfu/μg DNA,可用于各種多肽,蛋白表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建。




操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘,待其瀝干水分,正置5分鐘,待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中,壓實(shí)冰面,電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋,冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的BL21(DE3)電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5分鐘,待其融化,加入目的DNA (質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物)并用手bo打EP管底輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡,立即插入冰中。

      A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19;

      B. 對(duì)于連接產(chǎn)物,大部分公司的T4連接酶反應(yīng)體系或50度反應(yīng)重組體系可與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化,無(wú)需進(jìn)行DNA純化,但DNA濃度不能過(guò)高,DNA濃度不超過(guò)100 ng/μl,體積不超過(guò)5 μl/50 μl感受態(tài)。

      C. 對(duì)鹽濃度較高的DNA溶液或反應(yīng)體系請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸,然后與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。

 3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中,避免產(chǎn)生氣泡,蓋上杯蓋。

 4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀,設(shè)置參數(shù):C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù),也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參   數(shù)操作),將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中,電擊完成快速插入冰中。

 5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌S.O.C. 培養(yǎng)基(室溫),用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后,轉(zhuǎn)移到50 ml離心管(BD Falcon 50 ml錐形離心管等),向離心管中補(bǔ)加S.O.C. 培養(yǎng)基至10 ml。37℃,225 rpm復(fù)蘇60分鐘。

 6. 5000 rpm離心一分鐘收菌,重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的S.O.C平板上(因菌量較大,若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè))。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)13-17小時(shí)。



BL21(DE3)電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞


S.O.C 培養(yǎng)基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl2

10 mM MgSO4

20 mM glucose

PH-7.0


S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).


注意事項(xiàng)

1. 加入DNA時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

2. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

3. 當(dāng)DNA不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時(shí),轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo),增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

5. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)?;蛳氆@得較高轉(zhuǎn)化效率,推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍,轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

6. 對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化,部分公司的連接體系或重組體系(例如:Thermo,NEB公司的T4 連接酶系統(tǒng),NEB,天根的50度反應(yīng)重組系統(tǒng))可以直接與BL21(DE3)電擊感受態(tài)混合后電擊轉(zhuǎn)化,無(wú)需純化,但DNA濃度不能過(guò)高,盡量不超過(guò)100 ng/μl。過(guò)高濃度連接產(chǎn)物或過(guò)大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率,增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

7. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作,吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過(guò)猛,以免剪切力過(guò)大損傷細(xì)胞膜,降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?;蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量。

8. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞盡量保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。




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